Gen teknolojisinde devrim: CRISPR dünyayı değiştirecek

Bilim dünyası için nispeten yeni denebilecek CRISPR tekniğini bakteriler binlerce yıldır kullanıyor aslında. CRISPR kavram olarak, bakteri DNA’sında genetik materyali içeren kısımla ilişkili. Teknik geliştirilirken de bakterilerin savunma hücrelerinin karşılaşılan yabancı ajanları hafızasına kaydetme özelliğinden faydalanıldı.

CRISPR, yani açık haliyle ‘clustered regularly interspaced palindromic repeats’, Türkçe’ye ‘düzenli aralıklarla bölünmüş palindromik tekrar kümeleri’ olarak çevrilebilir. Bu tekrar kümeleri, DNA’daki yaklaşık 35 baz çifti uzunluğundaki bir dizinin belli aralıklarla, hemen hemen 4-5 kez tekrar etmesiyle oluşuyor. Bakteri DNA’larını inceleyen bilim insanları aslında 1980’lerden beri bu dizinlere rastlıyordu. CRISPR dizinlerinin görevi ve nasıl bakteri DNA’sına entegre olduğu ise daha sonra keşfedildi.

BAKTERİLERDEN YOLA ÇIKILDI

Bakteriler yaşam süreleri içerisinde mücadele verdikleri virüslerin DNA’sından bir parçayı yine aynı amaçla kendi DNA’larına ekliyorlar. Bu sayede benzer virüslerle karşılaştıkları takdirde çok daha güçlü yanıtla karşı koyarak tehlikeli durumu rahatlıkla atlatabiliyorlar. Bakteriler bunu DNA’daki nükleotitler arasındaki bağları kırabilen nükleazlar ile yapıyor. Birçok bakterinin bünyesinde benzer bir gen düzenleme sistemi var. İlk olarak 1987 yılında E. Coli-Koli Basili bakterisinde rastlanılan bu tekrar kümeleri, ilerleyen yıllarda genom dizileme ve sekans analizleriyle birlikte diğer canlılarda da keşfedildi. Bununla beraber bilim insanlarının daha çok ilgisini çekmeye başladı. Bu tekrar kümeleri 2002 yılında Hollandalı bilim insanları sayesinde CRISPR adını aldı. CRISPR ile ilişkili genler de Cas genleri olarak isimlendirildi.

2005 yılına gelindiğinde CRISPR sisteminin bir biyolojik savunma mekanizması olarak kullanılabileceği hipotezi ortaya atıldı. Bunun sebebi olarak palindromik tekrar kümeleri arasında yer alan DNA dizilerinin bazı virüslerin DNA dizileri ile aynı olması gösterildi. Bakteriler CRISPR kullanarak virüs DNA’sından parçalar çıkarıyor ve bir daha saldıracak olursa virüsü tanımalarına ve savunmaya geçmelerine yardımcı olması için birazını saklıyordu. DNA’daki tekrar eden dizinlerin arasındaki bölümler detaylı incelendiğinde mesele daha da garipleşti. Çünkü DNA parçaları bazı virüslerin DNA’sıyla birebir eşleşiyordu. İşin sırrı kendi DNA’sında virüs DNA’sından parçalar taşıyan bakterilerin o virüslere karşı dirençli olduğunun fark edilmesiyle açığa çıktı.

Nedir CSPR?

Virüs DNA’sından kopyalar alan bakteriler, o nükleotit dizisini baz alarak sentezledikleri RNA ve proteinlerle hücreye giren virüsleri hedef alıp parçalayan bir savunma mekanizmasına sahipler. Kısaca bakterilerin, saldırısından sağ kurtulmayı başardıkları virüslerin DNA’larından parçaları, kendi DNA’larına ekleyen ve bu sayede aynı virüsün sonraki saldırılarından korunmayı sağlayan bir savunma sistemi var. Hücreye giren her yeni virüsün DNA parçaları CRISPR dizilimi içinde kaydediliyor. Böylece bakteri DNA’sında bir liste çıkartılmış oluyor. Yani bakteriler hücrelerine giren ve kurtulmayı başardığı virüslerin birer kopyasını, adeta bir arananlar listesi şeklinde kendi DNA’sında saklıyor. Ortak DNA dizileri ise o virüslere karşı bir direnç gösterme mekanizması. Çünkü bakteriler bu sistemi işgalci patojenlere, örneğin virüslere karşı yanıt olarak kullanıyor.

Bir çeşit bağışıklık sistemi gibi olan CRISPR’ın keşfinin ardından bu alanda birçok çalışma yapıldı. Anlaşıldı ki bir hücrenin saldırılardan kurtulabilmesi için virüs listesine sahip olması tek başına yeterli değil. Bakterinin virüs kontrolü ele almadan DNA’sını tanıması ve parçalaması gerekli. İşte bu aşamada

CRISPR’dan sentezlenen RNA’lar ve Cas proteinleri devreye giriyordu. 2012 yılına gelindiğinde Jennifer Doudna öncülüğündeki ekip bakterilerde bulunan Tip-2 CRISPR sayesinde bir canlının DNA’sını kesebilecek, izole edebilecek ve düzenleyebilecek bir sistem geliştirdi. Cas9 enziminin insan genomu düzenlenmesinde de kullanılabileceği ise 2013 yılında keşfedildi.

Genoma ekleme çıkarma yapılabiliyor

DNA’yı yüksek hassaslıkta ve doğrulukta kesebilmek için gereken tek şey o DNA’nın dizisi, yani bazların sıralanışı ve hücre içinde RNP oluşturabilecek, aktif bir Cas9 proteini. Bundan hareketle DNA’nın bu baz dizisine denk gelen RNA molekülü oluşturuldu ve RNA molekülü Cas9 proteini ile birleştirilerek bir RNP kompleksi meydana getirildi. CRISPR-Cas9 sistemi, DNA’da değişiklik yani mutasyon oluşturan iki önemli molekülden oluşturuldu.

İlki Cas9 adlı bir enzim. Bu genomun belirli yerlerinden iki DNA iplikçiğini kesebilen moleküler bir makas görevi görüyor. Böylece DNA parçaları eklenebiliyor veya çıkarılabiliyor. İkincisi Rehber RNA (guide RNA – gRNA) denilen bir RNA parçası. Bu DNA’daki belirli bir dizilimi bulup bağlanmak için tasarlanıyor. Rehber RNA, genomdaki hedef DNA diziliminin bütünleyici RNA bazlarına sahip. Yani genomda sadece hedef dizilime bağlanıyor. Genetikçiler ve tıp araştırmacıları genetik mühendisliği tekniği olan CRISPR-Cas9 teknolojisiyle, genomun çeşitli kısımlarına ekleme veya çıkarma ya da DNA dizilimininde değişim yapabiliyor.

Gen mühendisliği etik mi?

Bilimsel problemler ve teknik eksiklikler bir yana, bu tarz bir gücün insan emrinde olması birçok etik soruyu da beraberınde getiriyor. Önerilen uygulamaların çoğu bedensel hücrelerin genomlarının düzenlenmesı ile ilgili olsa da üreme hücrelerinin düzenlenme potansiyeline ilişkin ilgi ve tartışmalar sürüyor. Çünkü üreme hücreleri üzerinde yapılacak değişiklikler nesilden nesile aktarılıyor. Haliyle olayın ahlaki bir boyutu var. Gelir dağılımının düzensiz olduğu günümüzde, imkan sahibi insanların çocukları zaten rahatlıkla ‘süper insan’ yapılabilirken, bir de nesilden nesile aktarılacak genetik değişikliklerle bu uçurumun daha da artması, belki de önlenemez hale gelmesi söz konusu. Tabi ki bunları gen düzenleme tekniğinin kim tarafından ve hangi amaçlarla kullanılacağı belirleyecek. Her teknolojik gelişmede olduğu gibi…

DNA onarım mekanizmasıyla değiştiriliyor

Cas proteinleri birer nükleaz (nuclease) yani nükleik asitleri kısmen veya tamamen parçalayan bir enzim ve çift sarmal DNA’yı kesmekle görevliler. Rehber RNA da daha uzun bir RNA iskeletin içindeki, önceden tasarlanmış küçük, yaklaşık 20 bazlık bir RNA diziliminden oluşuyor. Bakteri hücresinde kesilecek DNA bölümü crRNA denilen transaktive edici bir RNA türüne işleniyor. RNA’lar Cas9’a bağlanıp virüs DNA’sıyla eşleşiyor. Bu sayede Cas9 proteini de otomatik olarak virüs DNA’sına bağlanıyor ve sonrasında bağlanılan yeri çift sarmaldan kesiyor. Doğru yerleri kesen Cas9 enzimi rehber RNA’yı izleyerek, DNA’da ilgili yere gidiyor. Ardından virüs DNA’sını parçalıyor ve etkisiz hale getiriyor. Cas9 DNA’nın iki iplikçiğinde de kesik oluşturduğu aşamada hücre DNA’nın hasar gördüğünü fark edip onarmaya çalıştığı için, bilimciler DNA onarım mekanizmasını kullanarak, ilgilendikleri hücrenin bir ya da birden fazla geninde değişiklik yapabiliyor.

Daha basit terimlerle anlatmak gerekirse, DNA kesilerek içinden bozuk olduğu düşünülen parçayı çıkarmak veya yenisini yerleştirmek için RNA’larla hedef alınan kısımlar, aktif Cas9 proteini kullanarak kesiliyor. Sonrasında hücreye yama edilecek DNA parçaları enjekte ediliyor. Bu noktada yamanacak parça öyle bir ayarlamalı ki başı sonu orijinal DNA ile uyuşsun ve hücrenin sahip olduğu DNA tamir enzimleri gelip, sanki yama parçası orijinal DNA’daymış ama kopmuş gibi dikebilsin. Bu yönteme de homologous directed repair yani homoloji yönlendirmeli tamir deniyor.

CRISPR-CAS9 pek çok fayda sağlayacak

• CRISPR-Cas9 genetikçilerin ve tıp araştırmacılarının, genomun çeşitli kısımlarına ekleme, çıkarma ya da DNA dizilimininde değişim yapmalarına olanak tanıyan özgün bir teknoloji.

Sistem genetik bileşeni olan çok sayıda tıbbi rahatsızlığın, kanser, hepatit B ve hatta yüksek kolesterol gibi hastalıkların tedavisinde kullanılmak için yüksek potansiyele sahip. Şu anda varolan en basit, çok yönlü ve duyarlı genetik manipülasyon yöntemi CRISPR-Cas9 olduğundan, sistem bilim dünyasında büyük ilgi görüyor.

Bu tekniği kullanarak varılmak istenen nokta daha uzun ömür, hastalıklara karşı doğuştan bağışıklık, üstün zekalılık gibi pratik hayaller. Esas hedef ise genleri modifiye edebilmek ya da tamamen değiştirebilmek. Fakat bunlar genetik ya da biyoloji çalışmalarına yeni başlayanların zaten hep aklında olan şeyler. CRISPR-Cas9 sistemi ise bu doğrultuda iki amaca hizmet edecek şekilde kullanılabilir. İlk amaç düzgün çalışmayan ya da hastalıklara sebep olacak genlerin ve işlevsizleştirmek ve protein sentezini durdurmak. İkincisi ise organizmaya yeni özellikler kazandıracak genler eklemek ya da mevcut genlerin yerine daha istenilen özellikteki genleri embriyodan olmak üzere yerleştirebilmek.

Daha iyi hedefleme gerekiyor

Önceki tekniklerden daha hızlı, daha ucuz ve daha yüksek doğrulukta olan CRISPR-Cas9, bilim dünyasını heyecanlandıran bir genom düzenleme aracı. Üstelik geniş bir potansiyel uygulama yelpazesi var. Sistemle ilgili en büyük sorun ise hedef dışı etkiler. Bu problem rehber RNA’nın 20 bazlık belli bir dizilim taşımasından kaynaklanıyor. Çünkü 20 bütünleyici bazdan 19 tanesi genomda bambaşka bir yerde daha bulunabiliyor. Bu durumda rehber RNA’nın hedeflenmek istenen yere değil de oraya bağlanma riski doğabiliyor. O zaman Cas9 enzimi de yanlış yeri kesiyor ve olmaması gereken bir yerde mutasyona neden oluyor.

Bu problemin giderilmesine odaklanan çok sayıda çalışma var. Çünkü CRISPR-Cas9 sisteminin hedeflenen ve değiştirilmek istenen gen yerine başka bir noktada kesim gerçekleştirerek hata yapması bazen birey için zararsız olsa da kimi zaman son derece tehlikeli bir durum oluşturabilir. Bu yüzden bilimciler CRISPR-Cas9 sisteminin hatasız bağlanma ve kesmesini garantileyecek yollar bulmaya çalışıyor.

Daha iyi hedefleme için üzerinde çalışılan iki yol var. Genomun DNA dizilimi ve Cas9-gRNA kompleksinin farklı versiyonlarının hedef dışı davranışları hakkındaki bilgi kullanılarak, daha ayrıntılı rehber RNA’lar yapmak veya DNA’nın iki ipliğini birden değil de sadece tek ipliğini kesecek Cas9 enzimi kullanmak. Bu aynı anda iki rehber RNA ve iki Cas9 enzimi kullanmak ve böylece yanlış yerde kesim yapılma olasılığını düşürmek anlamına geliyor.

2017 yılında Salk Institute araştırmacılarının gerçekleştirdiği bir çalışmada CRISPR’ın en büyük sorunlarından olan genlerin eksiltilip eklenmesine odaklanıldı. Yeni teknikte Cas9 enzim sisteminin ölü formu olarak tabir edilen ve dCas9 adı verilen bir yapı kullanıldı. Yeni enzim genleri kesip çıkarmak yerine sadece onları susturuyor veya aktifleştiriyordu. Uzmanlar tekniğin teorik olarak çalıştığından emin olduktan sonra gerçek örnekler üzerinde denemelere başladı.

Yeni teknik, tip 1 diyabet, muskuler distrofi (kas erimesi) ve böbrek zedelenmesi durumları için test edildi. Yeni enzimle diyabet hastası farenin insülin üreten hücrelerinin büyümesi tetiklendi ve kan glukoz seviyesinde yüz güldüren sonuçlar elde edildi. Normal gen düzenleme tekniklerinin başarısız olduğu gen kaynaklı muskuler distrofi örneğinde de hastalığın belirtileri geri döndürülebildi. Böbreği hasarlı deney faresinin ise böbreğin temel fonksiyonlarından sorumlu 2 geni hedef alınmıştı. Düzenlenen genlere sahip böbreğin fonksiyonlarını geri kazandığı gözlemlendi.

Sistemin önünde uzun bir yol var

Testler başarılı ancak bu yeni yöntemin beraberinde getirdiği bazı ciddi sorunlar var. Bilim adamlarına göre tekniğin şu anda daha fazla hastalık üzerinde test edilmesi gerekli ve herhangi bir sakıncasının olup olmadığından emin olunması şart. Dolayısıyla gelişmenin hastalarda uygulanması için önümüzde oldukça uzun bir süreç var. Bununla beraber sistem düzgün çalışsa bile, gen entegre edilen embriyoların sağlıklı gelişimlerin devam ettirip ettiremeyeceği şüpheli. Özellikle böyle ciddi bir operasyon sonrası gelişen embriyolarda ne tarz yan etkiler görülebileceği henüz yeterince test edilmiş değilken.

Tüm bunlar gen düzenleme tekniğini insan gibi kompleks bir organizma üzerinde kullanabilmek için çözülmesi gereken problemler. Ayrıca CRISPR potansiyeli oldukça büyük bir gelişme. Bu teknik eğer doğru alanlarda kullanılırsa insanlığa büyük fayda sağlayabilir. Fakat henüz tam olarak anlaşılamamış bir yapı olan DNA üzerinde uygulandığı için istenmeyen sonuçların meydana gelmesi de söz konusu olabilir.

Çin'de yasadışı CRISPR-CAS9 kullanımı tutuklama getirdi

Üreme hücreleri üzerinde gen düzenlemesi yapmak, şu anda dünyanın pek çok ülkesinde yasadışı. ancak Çin’de bir bilim insanı geçtiğimiz aylarda dünyaya gelen ikizlerin genini henüz embriyonik dönemdeyken CRISPR-CAS9 yöntemiyle düzenledi. He Jiankuı ikiz kızların ccr5 genini sildi ve bunun sonucunda yetkililerce göz altına alındı. Bilim insanının yaptığı işlem fareler üzerindeki denemelere göre, temelde canlının inmelerden daha az etkilenmesini sağlıyor ve insana HIV’e karşı doğuştan bağışıklık kazandırıyor. Çünkü söz konusu virüs insan kan hücrelerine girmek için ccr5 genini kullanıyor. Buraya kadar her şey normal gibi gelebilir. Ancak ccr5 geninin silinmesi farelerde bilişsel faaliyetleri de geliştirdiği gözlemlenen bir müdahale. Yani ikizler normal bir insana göre daha zeki olabilir. Olayın duyulmasının ardından ileride süper zekalı insanların geliştirilebileceği ve bunun ABD-Çin arasındaki biyoteknoloji yarışında bir hamle olabileceği yönünde spekülasyonlar yayıldı. Gelişme bilim dünyasınca sorumsuzluk olarak değerlendirilirken, He Jiankuı bunu ikizlerin zekasını etkilemek için mı yaptı bilinmiyor.

Henüz çok erken

• Araştırmacılar yakın bir gelecekte CRISPR teknolojisinin genetik hastalıkların tedavisinde önemli katkılar sağlayacağını düşünüyorlar. Çünkü CRISPR-Cas9 sistemi şu anda genleri düzenlemek için en hızlı, ucuz ve güvenilir sistem olarak öne çıkıyor.

Fakat sistemin insanlarda rutin olarak kullanılır olmasına daha epeyce zaman var gibi görünüyor. Zaten araştırmaların çoğu hala model hayvanlar ve yalıtılmış insan hücreleri üzerinde yapılıyor. Faydaları tıptan tarıma, tarımdan ekosistem ekolojisine kadar uzanan bu yeni teknoloji insanlık için gerçekten ümit verici şeyler vadediyor. Özellikle başta kanser olmak üzere birçok hastalıkta yarar sağlaması umuluyor. Şimdiye kadar sağlanan yararları düşünecek olursak bu düşüncenin gerçekleşmesi oldukça mümkün. Esas amaç ise günün birinde bu teknolojiyi kullanarak insanlara rutin tedaviler yapabilmek ve istenilen genleri inaktif hale getirebilmek.

Mamutlar tekrar aramıza katılabilir

CRISPR-CAS9, genetik alanında şaşırtmaya devam ediyor. Öyle ki bazı bilim insanları birkaç yıl içinde tüylü mamutları gen düzenleme teknoloji CRISPR sayesinde geri getirmeyı bile amaçlıyor. Harvard Üniversitesi’nden Prof. George Church Arktık buzulunda binlerce yıl önce donmuş mamut dna’ları üzerinde çalışıyor. Özellikle de bu mamutları fillerden ayıran genler üzerinde… Ekip fil embriyosuna, mamut DNA’sı ekleyerek mamut-fil hibriti bir canlı oluşturmayı hedefliyor. Aslında araştırmacıların asıl hedefi mamut embriyosunu yapay bir rahimde büyüterek, sağlıklı bir filin üreme sistemini tehlikeye atmamak. Çünkü fil türlerinin de nesli tehlike altında. Prof. Church 2017 yılında konu hakkında “asıl hedefimiz hibrit fil/mamut embriyosu üretmek. Gerçekte bu mamut karakteristiğine sahip bir fil olacak. Henüz bu aşamaya gelemedik ama birkaç yıl içinde gerçekleştireceğiz” diyor.